In den Neubau des JKI-Fachinstituts für Pflanzenschutz in Obst- und Weinbau in Dossenheim sind auch Prüflabore (PL) des Nationalen Referenzlaboratriums eingezogen. Über die Aufgaben und Funktionen des Referenzlabors sprachen wir mit Kerstin Zikeli, Qualitätsmanagementbeauftrage der PL Bakteriologie, Entomologie, Phytoplasmen und Virologie in Dossenheim/Siebeldingen und stellvertretende Leiterin der PL Phytoplasmen, Bakteriologie und Virologie in Dossenheim, und Dr. Stefan König, Leiter des Prüflabors Nematologie in Braunschweig.
Was macht ein Labor zum Referenzlabor?
König: Als amtlich ernanntes Laboratorium handeln wir im gesetzlichen Auftrag. Jeder EU-Mitgliedsstaat muss jeweils ein Nationales Referenzlaboratorium für Lebensmittelsicherheit, Tierquarantäne und pflanzengesundheitliche Diagnose ernennen. In dieser Funktion führen wir zum Beispiel Eignungsprüfungen durch, versenden also Testproben mit von uns definierter Zusammensetzung an die Pflanzenschutzdienste der Länder und prüfen dann, ob die darin enthaltenen Schaderreger korrekt bestimmt werden. Außerdem schulen wir die Labore der Länderbehörden regelmäßig in Workshops.
Zikeli: Ein Referenzlabor gibt den Pflanzenschutzdiensten Hilfestellungen, beispielsweise indem es gestellte Diagnosen von Quarantäneschaderregern prüft und bestätigt, und stellt Referenzmaterialien zur Verfügung.
Sie sind also Aufsicht und Qualitätssicherung für andere Labore in Deutschland?
König: Wir unterstützen die anderen Laboratorien. Die Pflanzenschutzdienste haben die hoheitliche Aufgabe, Proben auf Schadorganismen zu untersuchen. Wenn sie nicht in der Lage sind, z.B. neu auftretende Schadorganismen zu bestimmen, müssen wir ran.
Zikeli: Die Akkreditierung von Labors erfordert Kompetenznachweise, und diese werden u.a. über die bereits erwähnten Eignungsprüfungen sichergestellt. Wir selbst nehmen an ähnlichen Eignungsprüfungen des Europäischen Referenzlaboratoriums teil.
Sie sprachen eben von Referenzmaterialien. Was genau ist das?
Zikeli: Referenzmaterial besteht z.B. aus Insektenpräparaten für die morphologische Bestimmung, aus Bakterienreinkulturen, aus mit Erregern infiziertem Pflanzenmaterial oder daraus gewonnenen Nukleinsäureextrakten. Für Prüfverfahren braucht es immer eine Positivkontrolle. Wir stellen Material zur Verfügung, das einen bestimmten Schaderreger enthält, teils auch eine definierte Menge des Erregers. Zu diesem Zweck unterhalten wir Sammlungen von Isolaten, sowohl von Quarantäneschadorganismen als auch von nicht-regulierten, taxonomisch oder physiologisch ähnlichen Organismen, die wir für die Abgrenzung benötigen.
König: Das Material muss die geografischen Gruppen des Schaderregers umfassen. Wir müssen also genauso Zystennematoden aus Peru vorhalten wie solche aus dem Emsland. Und wir brauchen die nächsten Verwandten, mit denen unser Erreger verwechselt werden könnte. Wir haben einige hundert Populationen mit ein paar Milliarden Nematoden im Kühlschrank.
Sehen Referenzlabore anders aus? Sind die Abläufe anders als in anderen Laboren?
Zikeli: Die Einrichtung ist ähnlich, aber die Abläufe unterscheiden sich etwas. Wir führen kaum Routineuntersuchungen durch, die bei den Pflanzenschutzdiensten den Alltag ausmachen.
König: Wir untersuchen Proben mit Kartoffelzystennematoden meist nur im Zuge von Eignungsprüfungen. Der Pflanzenschutzdienst in Niedersachsen untersucht pro Jahr 89.000 solcher Proben.
Wie viele Untersuchungen sind es bei Ihnen?
König: Wir sind gerade bei Probe 16 oder 17.
Zikeli: Bei den Insekten waren es bisher sechs Probenaufträge mit morphologischen Untersuchungen und molekularbiologischen Analysen. Bei den Phytoplasmen wurde bisher eine Probe untersucht. Aber da sich diese Quarantäneschaderreger weiter in Europa ausbreiten, dürften es in den kommenden Jahren deutlich mehr werden.
Für welche Organismen sind Sie zuständig?
König: Wir bestimmen alle Quarantäne-Nematoden. Das sind vor allem Kartoffelzystennematoden. Hinzu kommen einige Meloidogyne-Arten und der falsche Zystennematode.
Zikeli: Fünf der 17 JKI-Fachinstitute sind am Nationalen Referenzlabor beteiligt. Sie bringen ihre Expertise zu Schaderregern und Wirtspflanzen ein. Bei uns in Dossenheim und Siebeldingen bearbeiten wir in vier Prüflaboren die Quarantäne-Viren und -Bakterien aus dem Obst- und Weinbau, zudem haben wir die Prüflabore Entomologie und Phytoplasmen. Im Prüflabor Phytoplasmen sind wir für alle Quarantäne-Phytoplasmen zuständig, unabhängig von der Wirtspflanze.
Um wie viele verschiedene Erreger geht es da?
König: Wir prüfen auf 22 Nematodenarten, wobei lediglich der vom Arbeitsbereich Forstquarantäne von Dr. Hoppe bearbeitete Kiefernholznematode zu den prioritären Schaderregern der EU zählt und die übrigen Erreger sogenannte Unionsquarantäneschaderreger sind.
Zikeli: Bei den Insekten sind es weit über 40, teils sind nicht-europäische Arten ganzer Gattungen abzudecken. Dazu kommen aktuell drei Bakterien, über 15 Viren und vier Phytoplasmen. Bei letzteren erwarten wir demnächst einen großen Zuwachs.
Was geschieht, wenn ein neuer, noch unbekannter Erreger auftaucht. Wird der dann bei Ihnen identifiziert und charakterisiert?
Zikeli: Ja, das ist unser Ziel. Unsere Entomologen haben beispielsweise immer wieder mit neuen Arten von Schildläusen oder Zikaden zu tun, die wenig charakterisiert sind. So sind zum Beispiel noch keine Datenbankeinträge für molekularbiologische Analysen hinterlegt. Um diese Arten über das DNA-Barcoding, also den Nachweis einer charakteristischen DNA-Sequenz, bestimmen zu können, muss die entsprechende Gensequenz in den Datenbanken vorhanden sein. Liegen diese Sequenzen aber noch gar nicht vor, müssen wir sie durch Untersuchungen an den Insekten generieren. Teilweise ist unsere Forschung die Grundlage für die Entwicklung von Nachweismethoden.
König: In der Regel bekommen wir als Nationales Referenzlabor aber gezielte Prüfaufträge für bekannte Erreger. Aber gerade bei Viren werden mit High-Throughput-Sequencing-Methoden große Datenmengen produziert, was dazu führt, dass man darin immer mal wieder neue Viren entdeckt. In der Nematologie weiß man zumeist schon, womit man es zu tun hat.
Die Pflanzenschutzorganisation für Europa und den Mittelmeerraum (EPPO) veröffentlicht Standards für den Nachweis von Schadorganismen. Was enthalten solche Standards? DNA-Sequenzen?
König: Die DNA ist nur eines von vielen Merkmalen. Bei Insekten sind mitunter die Tarsen und andere Gliederungen des Körpers für die Bestimmung ebenso wichtig wie Erbgut-Sequenzen. Wenn die Morphologie nicht beschrieben ist, hilft die DNA in der Regel nichts. Und leider gibt es in den taxonomischen Datenbanken noch immer große Lücken, selbst bei Arten, die in der EU als wichtige Schadorganismen gelistet sind.
Zikeli: In der Virologie und der Bakteriologie kommen immunologische Nachweise über zum Erreger passende Antikörper oder Nukleinsäure-basierte Nachweise, also Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Real-Time-PCR zum Einsatz.
Die EPPO-Diagnostik-Protokolle enthalten Informationen zum Schaderreger, zu Wirtspflanzen, zur Symptomatik und zur Probenahme. Bei Untersuchungen auf Viren oder Bakterien wird zum Beispiel Pflanzenmaterial entnommen und so aufgearbeitet, dass Proteine oder Nukleinsäuren zugänglich werden. Außerdem werden verschiedene Verfahren für den Nachweis beschrieben, so dass es möglich ist, die Ergebnisse gegenseitig zu bestätigen.
König: Üblicherweise gibt es ein Detektionsverfahren, das schnelle Ergebnisse mit hoher Sensitivität liefert. Hinzu kommt ein Verifizierungsverfahren mit hoher Spezifität zur Bestätigung der Identität des Erregers. Für jedes Verfahren gibt es ein Protokoll mit exakten Vorgaben zu den verwendeten Chemikalien, Primern etc.
Diese Standards gibt zwar die EPPO heraus, aber die Daten und Grundlagen dafür liefern die Mitgliedsstaaten und deren amtlich benannte Labore wie wir.
Zikeli: Der EPPO-Diagnostik-Standard zur Rebkrankheit Flavescence dorée zum Beispiel enthält ein Protokoll, mit dem sehr schnell die Phytoplasmen-Gruppe nachgewiesen werden kann, zu welcher der Erreger zählt. In einem Forschungsprojekt, an dem auch das JKI-Institut für Pflanzenschutz in Obst- und Weinbau beteiligt ist, wird derzeit versucht, ein ähnlich schnelles Verfahren zu entwickeln, das dann den Erreger spezifisch nachweist.
Gibt es eigentlich Zielwerte zu Geschwindigkeit und Sensitivität solcher Methoden? Bei 89.000 Proben im Jahr muss das es ja offensichtlich schnell gehen.
König: Die Nachweisgrenze für unsere Ringtests ist eine einzelne Nematodenzyste auf 250 Milliliter. So eine Zyste hat einen Durchmesser von 0,35 Millimetern, und aus 400 Gramm Boden müssen sie dieses eine Ding „herauspulen“. Von diesen Bodenextraktionen können die Kollegen von der Landwirtschaftskammer in Hannover pro Stunde um die einhundert durchführen.
Zikeli: Da gibt es dann doch einen Unterschied zwischen den Laboratorien. Während wir unser Pflanzenmaterial per Hand mörsern, läuft bei den Pflanzenschutzdiensten vieles automatisiert mit Hilfe von Robotern.
Gibt es Unterschiede, die bei der Behandlung von Nematoden und Viren beachtet werden müssen?
König: Viren und Bakterien sind üblicherweise direkt in den Pflanzen bzw. in deren Zellen zu finden und müssen gemeinsam mit diesen extrahiert werden. Das gibt es zwar auch bei Nematoden, aber die meisten leben frei im Boden oder in Zysten im Boden. Die Nachweisverfahren z.B. auf der Basis der Erbinformation sind dann später aber dieselben.
Zikeli: Unterschiede gibt es dann bei der Pflanzenaufarbeitung, sie ist vom Pflanzenmaterial abhängig, je nachdem, ob es sich um krautige oder holzige Pflanzen handelt. Auch unterscheiden sich die Hemmstoffe, die die verschiedenen Pflanzen produzieren. Blattgewebe von Erdbeeren beispielsweise enthält viele Inhibitoren, die in extra Arbeitsschritten abgetrennt werden müssen.
Die Nachweismethoden sind also nicht nur erregerspezifisch, sondern auch angepasst an die Wirtspflanzen?
König: Richtig. Das ist die sogenannte Matrix, die mit dem Erreger und der Methode die Grundlage für das Verfahren darstellt.
Sie beide sind in sehr unterschiedlichen Situationen: Wie ist es, ein Referenzlabor in einer alten Liegenschaft einzurichten und wie, so etwas ganz neu aufzubauen?
König: Das Prüflabor in einem bestehenden Gebäude einzurichten, war in unserem Fall kein Problem. Die Nematologie ist im Vergleich zur Virologie ein etwas gröberes Geschäft. Für Nematoden gilt Sicherheitsstufe 2, die Tiere könnten lediglich mit dem Wasser aus dem Labor herausgetragen werden. Für diese Ansprüche sind die Labore in Braunschweig von Anfang an geplant worden. Und mit dem neuen Quarantänegewächshaus haben wir nahezu optimale Arbeitsbedingungen. Untersuchungsrückstände mit eventuell lebenden Tieren müssen aber auf jeden Fall nochmal thermisch behandelt bzw. autoklaviert werden.
Zikeli: Der Neubau in Dossenheim bietet ideale Bedingungen für den Aufbau der Prüflabore und des Qualitätsmanagementsystems. Die Prüflabore sind in einem abgetrennten Bereich untergebracht und erfüllen die Anforderungen einer Quarantänestation. Alle Abfälle von bakteriellen und viralen Quarantäneschaderregern, die das Labor verlassen, müssen autoklaviert werden. Bei den molekularbiologischen Prüfverfahren benötigen wir eine räumliche Trennung zwischen den einzelnen Arbeitsschritten. Dies ist in den Planungen bedacht worden. Für den Erhalt von Lebendmaterial als Referenzproben steht uns in Kürze zudem ein neu erstelltes Gewächshaus mit Quarantänebedingungen zur Verfügung.
Was sind die Herausforderungen, die künftig verstärkt auf das Referenzlabor zukommen werden?
Zikeli: Mit den höheren Temperaturen im Zuge des Klimawandels erreichen uns immer neue Schaderreger, deren Ausbreitung verhindert werden muss, beispielsweise Insekten, die als Vektoren für Viren oder Bakterien oder selbst als Schädlinge eine Gefahr darstellen. Weltweiter Handel und Tourismus tragen zusätzlich zur Verbreitung bei. Ein Beispiel ist die Flavescence dorée, eine durch ein Phytoplasma ausgelöste Vergilbungskrankheit der Rebe. Da der Vektor dafür, die Amerikanische Rebzikade, schon im Elsass aufgetaucht ist, erwarten wir in den nächsten Jahren vermehrt Untersuchungsanfragen dazu. Auch mit weiteren Phytoplasmen ist zu rechnen, dazu Insekten, die Xylella fastidiosa übertragen können. Bei Viren und Bakterien rechnen wir mit zunehmenden Analysen von Zitrus- und Kiwipflanzen.
König: Mit der neuen Pflanzengesundheitsverordnung hat die EU auch Monitoring-Aufgaben auf die amtlich benannten Laboratorien und Referenzlaboratorien übertragen. Mit den Kartoffelnematoden der Meloidogyne-Arten kommt zunächst auf die Länder eine große Herausforderung bei den molekularen Nachweisen zu. Allein dafür die Erhebungspläne zu schreiben, hat mich einen ganzen Monat gekostet. Und das muss für 40 bis 50 Arten gemacht werden.
Zikeli: Nach einem ersten Auftreten in einem Weinberg in Rheinland-Pfalz und nach erfolgter Rodung des betroffenen Rebstocks ist das Monitoring der Flavescence dorée und deren Vektor nun von zentraler Bedeutung, um eine epidemische Ausbreitung zu verhindern. An diesem Punkt zeigt sich die besonders enge Verbindung zwischen Nationalem Referenzlabor und Forschung.
Das Gespräch führte Johannes Kaufmann, Pressereferent am JKI